Генетично модифицирани организми: Създайте светещи бактерии!

Общ преглед

Този STEM проект е насочен към учители по биология в десети клас, които имат желание да покажат на учениците как се случват процесите на генетичната трансформация, като им да дадат възможност да се запознаят с начина на работата на генните инженери.

Как ще протече обучението?

• Основни концепции: учениците се запознават с функциите на белтъците и нуклеиновите киселини в клетките, откриват как с помощта на генното инженерство функциите на определен белтък могат да бъдат променени, как се изменя генотипа и фенотипа на организмите.
• Интерактивни учебни методи: проектът е многокомпонентен и включва използването на разнообразни ресурси, дискусии, експерименти и анализи, които да ангажират учениците и да създадат условия за продуктивна комуникация и работа в екип.
• Материали и ресурси: в хода на проекта учениците ще използват разнообразни материали и инструменти, например работни листове, микроскопски препарати, лабораторна стъклария и инструменти, онлайн ресурси и софтуер за анализиране на резултатите, които ще им помогнат в усвояването на учебния материал.

Занятия и дейности:

1. Въведение в темата: (Работа в клас 1 учебен час)
   • Припомняне на общите характеристики на прокариотните организми: учениците дискутират устройството на бактериите, основните им характеристики и значението им за живота на Земята. Разглеждат различните видове бактерии и основните клетъчни структури в техните клетки.
   • Определяне на функцията на белтъците и нуклеиновите киселини в клетката: учениците изследват процеса на производство на белтъци в клетката, определят през какви етапи преминава и кои са факторите, влияещи върху функциите, които белтъците изпълняват.
   • Запознаване с целите на проекта.
2. Провеждане на инструктаж за безопасност (Работа в клас, 10 минути)
3. Създаване на хранителна среда за отглеждане на бактерии (Работа в клас, 1 час)
4. Посявка на бактериите (Работа в клас, 30 минути)
5. Подготовка на бактериите за трансформация (Работа в клас, 1 час)
6. Посявка на трансформираните бактерии (Работа в клас, 30 минути)
7. Отчитане на резултати и указания за изчисляване на ефективността на трансформацията (Работа в клас, 1 час)
8. Изчисляване на ефективността на трансформацията (Домашна работа)
9. Заключителна част (Работа в клас, 1 час)
   • Представяне на резултатите, сравняване и обобщаване на получените резултатите и направените наблюдения.

Представете си, че можете да промените външния вид или функцията на всеки жив организъм в света. Можете да създадете котка с розова козина или да направите дърво, на което растат бонбони. Възможностите са безкрайни! Звучи ви като научна фантастика? Всъщност, това не е толкова невъзможно, колкото си мислите. Учените вече са измислили как да променят генетичния код на живите организми. Този процес се нарича генно инженерство, генна модификация или генна манипулация. Всички живи организми имат ДНК в клетките си, която съдържа генетичната информация за това как се развиват и функционират. Как можете да направите промени в тази генетична информация? Продължавайте да четете, за да разберете!

Същност на проекта

В този STEM проект учениците се запознават с работата на генните инженери и откриват същността на генетично модифицираните организми.

Учените могат съзнателно да модифицират ДНК на организми, като бактерии или растения, за да променят техните свойства за конкретна цел. Например културите могат да бъдат модифицирани, за да станат по-устойчиви на суша или вредители. Генното инженерство е много мощен инструмент в биотехнологиите, който вече е намерил различни приложения в селското стопанство, медицината и индустрията.

Учениците изследват същността на бактериите и условията, необходими за техния растеж и размножаване. С помощта на безопасен щам на бактерии Escherichia coli учениците отглеждат генетично модифицирани светещи колонии от бактерии, като вмъкват зелен флуоресцентен ген (GFP) в тяхната ДНК. За целта те въвеждат в бактериалните клетки специфичен плазмид, съдържащ този ген. По време на експеримента учениците променят условията на бактериална трансформация, за да определят как това се отразява на способността на клетките да поемат GFP плазмида и изчисляват каква е ефективността на трансформацията. Тя се определя от броя на успешните трансформанти (светещи бактериални клетки или колонии върху селективната плака), генерирани на микрограм плазмидна ДНК, използвана за трансформацията и разпръсната върху селективната агарова плака.

Цели по предметно знание

В работата по този STEM проект са заложени следните учебни цели:

• дефиниране на следните термини и понятия – ДНК, генно инженерство, ген, протеин, генетично модифициран организъм (ГМО), клетка гостоприемник, рекомбинантна ДНК, молекулярно клониране, плазмид, ефективност на трансформацията;
• описване на процесите репликация, транскрипция и транслация;
• определяне на функциите, които ДНК, РНК и белтъците изпълняват в клетките;
• разпознаване на основни лабораторни пособия и инструменти;
• изчисляване на необходимите количества материали и реактиви;
• анализ и графично представяне на данни.

Цели по ключови умения

• развиване на творческото мислене и предприемаческата компетентност на учениците, чрез намиране на иновативни решения за постигане на желан резултат;
• повишаване на аналитичното мислене на учениците, посредством откриване на причинно-следствените връзки между условията на средата и наблюдавания бактериален растеж;
• конструктивна работа в екип.

Времетраене

Работата по проекта може да бъде осъществена в рамките на четири-пет учебни часа, разпределени в една или две учебни седмици.

Необходими материали

За този STEM проект всяка от работните групи ще има нужда от следните материали:

• Около 6 гр. LB агар на прах;
• Около 3,5 мг. kanamycin;
• Стъклена бутилка 250 мл.;
• Пипета за еднократна употреба;
• Петриеви панички с диаметър 60 мм. – по 6 за всяка група;
• Инокулационни примки;
• Нитрилни ръкавици;
• Микроцентрофужни епруветки с вместимост 1,5 мл.;
• Центрофужна епруветка 50 мл.;
• 100 μl буфер за бактериална трансформация (25 mM CaCl2, 10% PEG 8000);
• Оранжев UV филтърен лист и синя светлина;
• Лиофилизирани непатогенни бактерии E. coli (DH5α);
• Стъклен цилиндър за измерване на вода;
• Стерилизирана вода;
• Лиофилизиран зелен флуоресцентен плазмид (GFP) – 10 μl;
• Молив или химикал;
• Прецизни пипети;
• Микровълнова фурна или котлон за загряване на водна баня;
• Електронна везна;
• Работен лист за изследване на бактериална ДНК трансформация.

Теоретична постановка

Генното инженерство използва биотехнология за промяна на гените на даден организъм. Генът е специфична ДНК последователност, която кодира синтеза на протеин. Информацията кодирана в ДНК се копира в РНК молекула по време на процес, наречен транскрипция. След това РНК се превръща в протеин по време на друг процес, наречен транслация. Протеините изпълняват много и най-различни функции в човешкия организъм –  например те помагат за храносмилането, поддържат сърдечния ритъм и контролират движението на мускулите.

Следователно ключът към промяната на свойствата или функцията на даден организъм е да се променят неговите гени. Това се постига чрез модифициране или изтриване на съществуващ ген в даден организъм или с добавяне на нов ген към неговата ДНК. Създаването на генетично модифициран организъм (ГМО) включва няколко стъпки. 

• Първо, генните инженери трябва да изберат гена, който искат да модифицират, вмъкнат или изтрият. 
• В следващата стъпка всички ДНК фрагменти, необходими за модификацията на организма, трябва да бъдат създадени и въведени в клетката гостоприемник. ДНК молекулите, които се образуват чрез лабораторни методи за създаване на нови ДНК последователности, се наричат рекомбинантна ДНК.
• Следващата стъпка е въвеждането на новосъздадената рекомбинантна ДНК в клетката на гостоприемника. За целта се използват вектори – това са ДНК молекули, които пренасят рекомбинантна ДНК в клетката гостоприемник. Най-често използваните вектори са плазмидите. Това са кръгови ДНК молекули, които естествено се срещат в бактериите. Те обикновено са малки, отделни от хромозомната ДНК на клетката и често носят гени, които осигуряват полза за бактериите, като резистентност към антибиотици. За молекулярно клониране се създават изкуствени плазмиди и целевият ген или ДНК последователност се включва в плазмидната ДНК. По този начин целият плазмид, включително рекомбинантната ДНК, може да бъде въведен в бактериалната клетка гостоприемник.

Действителната модификация на генетичния материал на бактериите се случва, когато рекомбинантната ДНК е интегрирана в бактериалната клетка. Поглъщането на плазмида в бактериалната клетка се нарича трансформация. По време на трансформация не всяка бактериална клетка ще промени своята ДНК, поради което успешно трансформираните бактерии трябва да се разграничават от неуспешните. За тази цел използваните плазмиди обикновено съдържат допълнителен селективен маркер освен целевия ген или променена ДНК последователност. Този маркер, който често е ген за резистентност към антибиотици,  позволява селективно да бъдат отглеждани генетично модифицираните бактерии върху агарови плаки, които съдържат специфичните антибиотици.

В този STEM проект учениците създават генетично модифицирани светещи бактерии Escherichia coli, въвеждайки зелен флуоресцентен ген (gfp) в тяхното ДНК. GFP произхожда от медуза и често се използва в биотехнологиите за маркиране на определени клетки. За да въведат GFP гена в клетките гостоприемници, учениците използват плазмид, който съдържа този ген. След като плазмидът бъде успешно поет от клетките на E. coli, те ще флуоресцират под UV светлина. 

В процеса на работа учениците използват два различни вида агарови плаки – LB агар и LB Кан агар. Те се използват в микробиологията и култивацията на бактерии. LB агар се състои от агар-агар, пептон (протеинов източник), екстракт от мая (съдържа витамини и аминокиселини) и натриев хлорид (сол). Често се използва за изолиране на бактерии, тестове за чувствителност към антибиотици и други микробиологични експерименти. LB Кан агар съдържа същите компоненти като LB агар, но с добавка на антибиотика канамицин. Използва се за селективно култивиране на бактерии, които са устойчиви към този антибиотик. Това позволява изолирането на клетки, които носят специфични гени или плазмиди, които съдържат резистентност към него.

Подготовка

1. Уверете се, че всички реактиви и пособия, които ще използвате за експеримента отговарят на изискванията за безопасност на употреба.
2. Пригответе необходимите количества растежна среда, лиофилизиран плазмид и лиофилизирани непатогенни бактерии.
3. Осигурете необходимия набор от пособия за всяка работна група.

Ангажиращо въведение

• Дискутирайте устройството на бактериите, основните им характеристики и значението им за живота на Земята. Разгледайте как изглеждат различните видове бактерии, какви са основните клетъчни структури в техните клетки. За целта можете да използвате предварително подготвени микроскопски препарати, микроскопски снимки от интернет, образователни платформи или учебни помагала. 
• Разгледайте процесите на белтъчен синтез в клетката. Какво е необходимо, за да се произведе точно определен вид белтък?
• Организирайте кратка мозъчна атака, като възложите на учениците да помислят как би могла да бъде променена функцията на даден белтък или да бъде подтикната клетката да произвежда непознат за нея белтък, изпълняващ неприсъща за клетката функция.
• Запознайте учениците с целите на настоящия STEM проект и раздайте на всеки ученик по един работен лист. В него те трябва да запишат вече обсъдените характеристики на бактериите, както и същността на процесите репликация, транскрипция и транслация.

Изпълнение

Преди да започнете същинската работа по проекта, трябва да проведете инструктаж за безопасна работа с бактериите и лабораторната стъклария. Бактериите са навсякъде около нас в ежедневието ни и по-голямата част от тях не са вредни. Въпреки това, за максимална безопасност, всички бактериални култури винаги трябва да се третират като потенциално опасни. Това означава, че са необходими правилно боравене, почистване и изхвърляне. Ето няколко важни напомняния за безопасност:

• Дръжте носа и устата си далеч от цилиндри, петрита, пипети или други инструменти, които влизат в контакт с бактериални култури, за да избегнете поглъщане или вдишване на бактерии.
• Ръцете трябва да се измиват старателно след работа с бактерии.
• Бактериални култури, чинии и материали за еднократна употреба, които се използват за манипулиране на бактериите, трябва да се накиснат в 10% разтвор на белина (една част белина на девет части вода) за 1-2 часа.
• Бъдете внимателни, когато боравите с белина, тъй като тя може да съсипе дрехите, ако се разлее, както и да бъде вредна при попадане в очите.
• След приключване на обработката с белина, отпадъците вече не са опасни и могат да бъдат третирани като обичайните ви битови отпадъци.
• В края на експеримента работните места се почистват с дезинфектант, например 70% етанол, 10% разтвор на белина или търговски антибактериален разтвор за почистване на кухня/баня.

След като учениците се запознаят с целите и изискванията по проекта, всички трябва да заемат работните си места и поставят на ръцете си нитрилни ръкавици. Растежната среда, която ще приготвят, е подходяща за развитие на бактерии и дрожди, които естествено се срещат във въздуха и върху кожата. Замърсяването на пробите трябва да се избегне, за да могат да се получат оптимални резултати.

Създаване на хранителна среда за отглеждане на бактерии

• С помощта на изопропилов алкохол екипите стерилизират ръцете, ръкавиците, повърхностите и уредите си, преди да извършат експеримента.
• Първата фаза от настоящия експеримент е приготвянето на растежната среда. За целта учениците от всяка работна група използват LB агар на прах, дестилирана вода и мерителен цилиндър, с който да измерят 150 мл. вода.
• Всеки екип трябва да изчисли какво количество агар ще бъде необходимо за приготвянето на 150 мл. бульон, ако се знае, че за един литър са необходими 35 гр. След това измерва необходимото количество LB агар на прах и го изсипва в стъклена бутилка с вместимост 250 мл.
• С помощта на мерителен цилиндър се измерват 150 мл. дестилирана вода и се добавят към агара на прах в стъклената бутилка. Като алтернатива може да се използва центрофужна епруветка с обем 50 мл., с която да се измерят три пъти по 50 мл.
• Бутилката се разклаща енергично, за да се смесят добре съставките.
• След това отгоре се поставя капачка, без да се затваря добре. Проверете как са затворени капачките на всички групи. Ако са затегнати има вероятност бутилката да експлодира при нагряването ѝ в следващата стъпка. 
• Приготвените бутилки с LB агар се поставят в микровълнова фурна или на водна баня, за да може агарът да се разтвори. Уверете се, че учениците разполагат с щипка или ръкохватки, за да не изгорят ръцeте си при изваждането на бутилката от микровълновата или съда с гореща вода.
• Независимо дали използвате микровълнова фурна или водна баня, бутилките трябва да се изваждат на всеки 30 секунди и да се проверява разтвора. Учениците трябва да наблюдават за признаци на кипене. Разтворът не трябва да заври. Ако се наблюдават признаци на кипене, бутилката трябва да се извади и да се отвори внимателно капака, без да се разклаща. Оставя се да почива за минута, след което се връща в микровълновата или на водната баня докато агарът се разтвори напълно. Обикновено процесът отнема приблизително 2 до 4 минути. Агарът е готов, когато може да се вижда ясно през него.
• Когато бульонът е готов, той се оставя настрана да се охлади за 30 минути или докато може да се държи в ръка, без това да причинява дискомфорт.
• През това време учениците трябва да почистят работното си място, да приготвят петриевите панички и да ги надпишат. В три от паничките учениците ще поставят LB агар, а в другите три – LB Kan агар. Върху капачетата на петритата се записва средата, която ще бъде поставена вътре.
• Когато агарът изстине до около 55 градуса, той се разделя по равно в две бехерови чаши. Ако учениците са работили правилно, в двете чаши трябва да има по 70-75 мл.
• В приготвените панички за LB агар се разпределя бульонът от едната бехерова чаша, като учениците трябва да внимават да не препълват паничката. Количеството на агара трябва да достига до 3-4 мм. от дъното на петрито. Надписаните капачета се поставят отгоре.

• За приготвянето на LB Kan агар учениците ще използват бульона от втората бехерова чаша и ще добавят към него необходимото количество kanamycin. За един литър бульон са необходими 50 мг. kanamycin. Учениците сами трябва да пресметнат какво количество ще им бъде нужно, според обема на агара в бехеровата им чаша. Така приготвената смес се поставя в останалите три петриеви панички, като отново се внимава да не се препълват. Надписаните капачета се поставят отгоре.
• След това петритата трябва да се оставят да се охладят. Това обикновено отнема между 30 минути и 1 час, като можете да ускорите процеса ако ги поставите в хладилник.
• Когато хранителната среда се втвърди, петритата се обръщат наобратно – с капака надолу, за да не капе конденз върху агара. По възможност оставете петритата за няколко часа на маса или рафт, за да се изпари част от конденза. След това трябва да се съхраняват в хладилник докато дойде време за следващия етап от работата. В зависимост от количеството на конденза и колко стерилно са работили учениците, агарът може да се използва в рамките на 2 до 3 месеца.

Посявка на бактериите

Следващият етап от работния процес е активирането на бактериите и посяването им върху растежната среда.

• В микроцентрофужната епруветка с поставените в нея лиофилизирани бактерии (DH5α) се добавят 4-5 капки стерилизирана вода. Разклаща се енергично една минута, докато се разтворят добре бактериите.
• С помощта на пипета за еднократна употреба учениците капват по една капка от бактериалния разтвор в едно от трите петрита с LB агар и в едно от петритата с LB Kan агар.
• С помощта на инокулационни примки учениците разпределят бактериалния разтвор по цялата повърхност на растежната среда. Инструктирайте учениците да придвижват примките по повърхността на агара много леко и внимателно, така че да не се нарушава неговата цялост.

• Петрирата се оставят на стайна температура за 1-2 дни или докато започне да се наблюдава появата на бактериални колонии. Могат да се съхраняват и в хладилник за около седмица, но свежите бактерии, отглеждани на стайна температура, осигуряват по-добри шансове за успеваемост на експеримента. Какви промени се наблюдават? И в двете петрита ли има бактерии? На какво се дължат получените резултати?

Подготовка на бактериите за трансформация

Ако учениците правилно са работили в предходните етапи, те вече разполагат с пресни култури от бактерията E. coli. Техните клетки ще бъдат използвани в следващия етап на генетична трансформация.

• За начало, всяка работна група трябва да разполага с една микроцентрофужна епруветка с 0,1 мл. буфер за бактериална трансформация (25 mM CaCl2, 10% PEG 8000). Ако не сте подготвили предварително необходимите количества от буферния разтвор, можете да възложите на учениците да го направят сами с помощта на прецизна пипета.
• След това учениците трябва да съберат свежи бактерии от петриевите блюда с помощта на иноклулационна примка. За целта те внимателно остъргват бактериалните колонии от агара, докато примката се запълни. Уверете се, че учениците са събрали само бактерии, без участъци от растежната среда.
• Събраните бактерии се поставят в буферния разтвор и се разбърква енергично, докато бучките изчезнат. Поради малкото количество на течността, тази задача може да се окаже трудна. Може да се наложи учениците да използват пипета, с която неколкократно да всмучат и върнат обратно сместа в епруветката. Това ще помогне за по-доброто смесване на съставките. Полученият разтвор трябва да изглежда мътен и да не бъде твърде прозрачен. Ако той все още е бистър, учениците трябва да добавят още бактрерии и да разбъркат отново.
• В микроцентрофужната епруветка с лиофилизирания зелен флуоресцентен плазмид учениците добавят две капки стерилизирана вода с помощта на пипета за еднократна употреба.
• Епруветката се затваря и се разтръсква енергично в продължение на една минута.
• Разтвореният плазмид се добавя към приготвената преди това смес за бактериална трансформация.
• Готовата смес се поставя в хладилник за половин час.
• На дъното на микроцентрофужна епруветка се поставя малко количество LB агар на прах. С помощта на пипета епруветката се допълва с вода, така че да остане място за разтърсване на разтвора и разтваряне на агара.
• Малко количество вода се загрява до 42 градуса целзий. Микроцентрофужната епруветка със сместа за бактериална трансформация се изважда от хладилника след изтичане на посоченото време и се поставя в топлата вода. За да тествате по какъв начин температурния шок оказва влияние върху бактериалната трансформация, нека всяка работна група да остави трансформационната смес в топлата вода за различен период от време:
  • група едно – за период от 15 секунди;
  • група две – за период от 30 секунди;
  • група три – за период от 45 секунди;
  • група четири – за период от 60 секунди.
• Избраните условия за провеждане на топлинния шок се записват върху петриевите панички на групата, както и в работните листове на учениците.
• Половината от новоприготвения агаров разтвор се прехвърля в епруветката с трансформационната смес с помощта на пипета. Компонентите се смесват внимателно с леко стръскване.
• Получената смес се оставя да престои на стайна температура за поне два до четири часа. Този етап е ключов за успеваемостта на експеримента, затова не скъсявайте времето за инкубация. То е необходимо на бактериите, за да могат да приемат непознатата ДНК и да я репликират. Ако не можете да продължите експеримента след 2-4 часа, можете да удължите времето на престой до 12 часа. Това ще увеличи и шансовете за успеваемост на експеримента.
• Докато трае процесът на трансформация, учениците трябва също да извадят останалите си петрита (две с LB агар и две – с LB Kan агар) от хладилника и да ги оставят на стайна температура да се темперират.

Посявка на бактериите

След като учениците вече са подготвили своите генномодифицирани бактерии и са изчакали необходимото за бактериалната трансформация време, те трябва да направят посявка на своите бактерии, за да проверят до каква степен новият ген е усвоен.

• Подготвената смес за бактериална трансформация се разпределя между четирите петрита, с помощта на пипета. Три – четири капки са достатъчни за посявката на едно петри.
• Учениците разпределят внимателно сместа по повърхността на растежната среда, като използват инокулационна примка и внимават да не наранят повърхността на агара.
• Петритата се оставят отворени настрана за поне 10 минути, за да може да изсъхнат добре преди да се затворят.
• След това петриевите панички се затварят и се обръщат наобратно, за да не пада конденз върху посятата растежна среда.
• Така приготвените проби се оставят на стайна температура за 36 – 48 часа. Това време е необходимо за формирането на новите бактериални колонии.

Отчитане на резултатите

Когато бактериите прорастнат, учениците трябва да отчетат получените резултати. На пръв поглед бактериите изглеждат съвсем обикновени. За да проверите дали зеления флуоресцентен ген е усвоен от бактериите, трябва да осветите колониите със синя светлина през оранжев UV филтърен лист. 

• За начало, учениците трябва да преброят колко светещи колонии има във всяка петриева паничка. Добър начин учениците да направят това е да маркират всяка преброена колония с точка, за да са сигурни, че всяка колония е преброена само веднъж. Общият брой единици, образуващи колонии (cfu) за всяка от петриевите панички, се записва в работните листове.
• След това се изчислява средния брой светещи колонии за всяко условие на трансформация. Всяка работна група трябва да изчисли две средни стойности – една за петриевите панички с LB агар и една – за тези с LB Kan агар. Получените стойности се записват в работните листове.
• За да се определи при какви условия трансформацията е протекла най-добре, учениците трябва да изчислят ефективността на трансформацията за всяко от тестваните условия. Това може да се направи като се раздели броя на светещите бактерии на количеството GFP плазмидна ДНК, използвано при посявката. За целта първо трябва да се изчисли общото количество плазмидна ДНК, която учениците са използвали. Необходима им е първоначалната концентрация на използвания ДНК плазмид и обема на плазмида, който се добавя към сместа за трансформация. Трябва също така да се вземе под внимание, че се добавя LB среда към сместа за трансформация и се използва само част от този обем за действително разпръскване върху плочите с агар. Ето основните стъпки, които учениците трябва да следват при изчисленията:
  • Определяне на общото количество GFP плазмидна ДНК, използвано в експеримента.
  • Определяне каква част от GFP плазмидна ДНК е действително разпръсната върху плочките с LB/Kan агар.
  • Изчисляване на общото количество GFP плазмидна ДНК, разпръсната върху LB/Kan агарните плаки.
  • Използване на средния брой светещи колонии и изчисленото количество GFP плазмидна ДНК, разпръсната върху плаките, за да се изчисли ефективността на трансформация за всяко условие.

Примерно изчисление:

В експеримент 10 μl плазмид при концентрация от 0,08 μg/μl се добавят към 100 μl смес за трансформация. След трансформацията 400 μl LB среда се добавят към сместа за бактериална трансформация. Накрая, 100 μl от получената смес, се разпръскват върху плочата с агар. На следващия ден 190 зелени флуоресцентни клетъчни колонии се преброяват в плаката.

Общото количество ДНК, използвано в експеримента (μg) = Концентрацията на плазмидната ДНК (μg/μl) × Обема на ДНК (μl) = 0.08 μg / μl × 10μl = 0,8 μg ДНК

Фракцията на ДНК, използвана за посяване = използвания обем за посявката (μl) /общия обем на трансформационната смес (μl) = 100μl /510 μl = 0,2

Бележка: Общият обем на трансформационната смес включва 10 μl плазмид, 100 μl трансформационен буфер и 400 μl LB бульон, или общо 510 μl.

Изхождайки от тази информация, общото количество плазмидна ДНК разпръснато върху агаровите плаки може да се изчисли по формулата:

Количество плазмидна ДНК върху плаките (μg) = общото количество ДНК, използвано в експеримента (μg) х фракцията на ДНК, използвана за посяване = 0,8 х 0,2 = 0,16 μg плазмидна ДНК

Следователно ефективността на трансформацията = броя светещи колонии/количество плазмидна ДНК върху плаките (μg) = 190 /0,16 = 1 187.5 cfu/μg

• Сравнете различните ефективности на трансформация, получени от различните работни групи. Как се различават? При кое условие на трансформация ефективността ѝ е най-висока или най-ниска? Как се различават резултатите при използваните растежни среди? Защо едно условие на трансформация работи по-добре от друго?

Заключителна част

Всички работни групи представят резултатите от своя експеримент, като показват отгледаните в своите петрита бактерии и направените изчисления. Обясняват резултатите и направените наблюдения.

Въз основа на направените сравнения между резултатите на различните работни групи, всички ученици правят сборна графика, отразяваща ефективността на трансформацията при всички изследвани условия.

• Дискутирайте каква е ролята на плазмидите в молекулярното клониране и как можете да увеличите или намалите ефективността на трансформацията.
• Как се използват генетично модифицираните организми (ГМО) днес? С какво може да бъде полезна за хората модификацията на ДНК?

Възможности за надграждане на проекта

• Разберете как температурата на топлинния шок влияе върху ефективността на трансформацията. Повторете експеримента, но този път поддържайте времето на топлинния шок постоянно на 30 секунди и променяйте температурата на водата. Увеличаването или намаляването на температурата на водата оказва ли влияние върху ефективността на трансформацията?
• Колко важна е фазата на възстановяване на клетките след третирането им с топлинен шок? Разберете как се променя ефективността на трансформацията в зависимост от това колко време възстановявате клетките след топлинния шок.
• Въпреки потенциалните ползи и обещания на генното инженерство, съществуват и опасения и рискове, свързани с ГМО, които трябва да бъдат взети предвид. Направете проучване и намерете аргументи “за” и “против” използването на ГМО.
• В този проект сте създали бактерията Escherichia coli. Можете да направите същия експеримент с еукариоти, например дрожди.

За какво да внимаваме

Запознайте учениците с правилата за безопасност. Бактериите (Escherichia coli), използвани в този експеримент, са безопасни и непатогенни. Необходимо е да се носят ръкавици по време на експеримента, за да може да се работи по възможно най-стерилен начин. Бактериите трябва да бъдат инактивирани с белина преди изхвърляне.

Този интересен STEM проект дава пряк поглед на учениците върху една сфера на науката, която е изключително непозната за повечето от тях, а същевременно стои в основата на множество научни достижения, оказващи влияние върху качеството на човешкия живот. Извършваните дейности отразяват реални задачи от ежедневната работа на специалисти, работещи в сферата на микробиологията, генетиката и биотехнологиите. Освен че показва на учениците посока за професионално развитие, този STEM проект им дава възможност по-добре да осмислят същността на ДНК и начина, по който записаната в нея информация се реализира от клетката.

За статията са използвани следните ресурси, които са допълнени с личния опит на автора:

• Genetic Engineering to Create Glowing Bacteria | Science Project (sciencebuddies.org)
• Current Illustrated Bacterial Genetic Design GFP Kit – Freeze Dried Plasmid – Google Документи
• Addgene: Pouring LB Agar Plates